【人物与科研】中国药科大学涂家生教授、孙春萌副教授课题组：序贯式酶触发“前体多胺”纳米药物靶向肿瘤线粒体的研究

导语

肿瘤细胞通过异常的代谢维持其快速增殖、侵袭及转移，例如：葡萄糖与氨基酸摄取失控、氮源需求增加等。线粒体是肿瘤细胞代谢的主要场所，是细胞生命活动的能量供应工厂，同时也是控制细胞程序化死亡中重要的细胞器。肿瘤细胞线粒体与正常细胞线粒体相比，代谢更为活跃，可调控细胞内 ROS、ATP水平、信号传导和细胞凋亡等，因此，线粒体成为肿瘤代谢治疗的重要靶点。然而，常见的肿瘤细胞靶向策略多采用阳离子载体制备纳米药物递送系统，这往往会增加纳米粒的清除、降低肿瘤靶向性、引发机体毒性，利用肿瘤微环境或人工干预实现纳米药物在肿瘤区域的特异性活化已成为研究热点。近日，中国药科大学涂家生教授、孙春萌副教授课题组在该研究领域取得了新突破（Advanced Functional Materials, 2020, 1904697）。

涂家生教授、孙春萌副教授课题组简介

课题组主要研究方向主要包括：药用辅料的开发、质量控制及其应用，新型药物递送系统的研究，环境敏感型多肽的设计和应用，融合蛋白的构建，生物大分子药物递送等。近年来在肿瘤联合免疫治疗、纳米药物递送、智能响应型载体等研究领域取得了一系列的进展，在Nature Communications, Advanced Functional Materials, Journal of Controlled Release, Biomaterials等杂志发表SCI论文数十篇。

涂家生教授简介

涂家生，三级教授，博士生导师。1986年6月于北京医科大学（现北京大学医学部）获学士学位，1992年6月于中国药科大学获博士学位，2001-2003年在美国University Of the Pacific和University of California at San Francisco从事博士后学习和研究。先后担任第九、十届国家药典委员会委员，现任第十一届国家药典委员会执行委员（药用辅料和药包材专业委员会主任委员）、美国药典委员会委员、国家药品审评中心首批专家库专家、国家药用辅料工程技术研究中心专家技术委员会副主任、美国University of the Pacific客座教授、江南大学兼职教授、Asian Journal of Pharmaceutical Sciences和《中国新药杂志》编委等。

孙春萌副教授简介

孙春萌，副教授，博士生导师。现任药学院药剂系副主任，共青团中国药科大学委员会副书记（兼）。江苏省“六大人才高峰”高层次人才，原国家药品审评中心外聘审评员，Asian Journal of Pharmaceutical Science青年编委，ACS Nano、Advanced Science等杂志同行评议专家。2011-2014年在美国University of Southern California进行博士联合培养，2014年于中国药科大学获博士学位后留校任教至今。先后主持国家科技重大专项子任务、国家药典委员会专项课题研究、国家自然科学基金面上和青年项目、江苏省自然科学基金等课题十余项，为2020年版《中国药典》起草和修订通则、指导原则、通用检查法等5项。

前沿科研成果

酶敏型“前体多胺”修饰纳米药物序贯靶向肿瘤细胞线粒体研究

对于目前的抗肿瘤纳米药物来说，如何实现体内长循环、肿瘤部位高效富集、被肿瘤细胞有效摄取并特异性靶向线粒体是其面临的主要挑战。课题组研究人员发现，β-葡萄糖醛酸酶（β-Glucuronidase, β-G）在肿瘤细胞外液和溶酶体内均特异性高表达，有希望成为纳米药物实现肿瘤靶向性和细胞器靶向性的新靶点。基于此，研究人员使用β-G的底物---β-葡萄糖醛酸对阳离子脂质Staramine进行修饰，同时在β-葡萄糖醛酸和Staramine间引入一段可发生1,6-自消除的无缝连接键（seamless linker），构建可特异性响应β-G的新型脂质，并首次提出Pro-staramine（前体多胺脂质）这一全新概念。

随后，课题组研究人员使用Pro-staramine、磷脂、胆固醇制备表现为负电性的脂质体，当纳米粒抵达肿瘤区域后，修饰于脂质体表面的Pro-staramine可在β-G的作用下脱去葡萄糖醛酸，seamless linker随即可发生1,6-自消除，暴露staramine，使脂质体由负电性转变为正电性，从而增加肿瘤细胞对其内吞作用，并在溶酶体中被β-G进一步激活暴露更多氨基，通过质子海绵效应实现溶酶体逃逸，进而通过电荷作用靶向肿瘤细胞线粒体，实现序贯式活化、逐级靶向的药物递送（图1）。

图1. 前体多胺脂质的构建和应用机理图

（来源：Advanced Functional Materials）

随后，课题组研究人员对Pro-staramine修饰的脂质体（GluAcNA-Lip）进行了体内外评价。首先，体外研究表明，GluAcNA-Lip具有理想的粒径（~100nm）、酶敏性和pH缓冲能力（图2）。

图2. GluAcNA-Lip理化性质评价

（来源：Advanced Functional Materials）

为了证明GluAcNA-Lip能够通过细胞内吞作用进入内涵体/溶酶体，进一步被激活，课题组研究人员对GluAcNA-Lip的细胞摄取能力和摄取机制进行了研究。结果表明，与β-G共孵育能够显著提高GluAcNA-Lip内化能力，内化后的脂质体分布于内涵体/溶酶体中，并随时间推移，发生溶酶体逃逸（图3）。

图3. GluAcNA-Lip细胞摄取、摄取机制和溶酶体逃逸研究

（来源：Advanced Functional Materials）

进一步，课题组研究人员通过激光共聚焦显微镜观察到经过细胞内化和溶酶体逃逸后的GluAcNA-Lip具有良好的线粒体靶向作用，证实了GluAcNA-Lip被逐级激活，形成具有阳离子特性的staramine修饰脂质体---NDOA-Lip（图4）。

图4. GluAcNA-Lip线粒体靶向性

（来源：Advanced Functional Materials）

考虑到β-G水平对GluAcNA-Lip激活具有显著影响，且β-G主要由肿瘤组织中，尤其是坏死区域的免疫细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞等）分泌，研究人员采用免疫荧光考察了肿瘤组织中β-G、中性粒细胞、巨噬细胞水平，证实了肿瘤组织中β-G的高表达（图5-6）。

图5. 肿瘤组织中β-G水平

（来源：Advanced Functional Materials）

图6. 中性粒细胞和巨噬细胞在不同体积肿瘤中的浸润情况

（来源：Advanced Functional Materials）

最后，研究人员通过动物实验，进一步证明了GluAcNA-Lip具有良好的抗肿瘤作用，并能显著提高半数生存期、抑制肿瘤转移。

图7. GluAcNA-Lip体内药效学评价

（来源：Advanced Functional Materials）

这一成果近期发表在材料学权威杂志Advanced Functional Materials上（Advanced Functional Materials, 2020, 1904697），中国药科大学博士后杜运爱和博士研究生李亚楠为本文共同第一作者，中国药科大学涂家生教授、孙春萌副教授和大连理工大学孙文副教授为共同通讯作者。上述研究工作得到了科技部、国家自然科学基金委、中国博士后科学基金、中国药科大学中央高校基本科研业务费等基金资助。

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